第２幕。第１場。
宮殿の大広間。二重唱。アッスールがセミラーミデに自分を国王に選ばなかったことを怒るが、セミラーミデはアッスールを退ける。
第２場。聖堂の内部。アルサーチェはオーロエから自分が前王ニーノの息子、ニーニャ王子であり、母はセミラーミデであることを知らされる。さらにニーノの遺書にはアッスールとセミラーミデにより毒殺されたと記されていた。オーロエは復讐を求めるが、アルサーチェはアッスールは倒せるが、母であるセミラーミデは殺せないと母の許に行く。
第３場。セミラーミデの部屋。女王はアルサーチェから全てを知らされる。アルサーチェは母との再会を喜ぶが、セミラーミデはアルサーチェに、自分を殺して父の仇を打てと言う。しかしアルサーチェにはできない。アルサーチェはアッスールに復讐を果たすと言って去る。
第４場。ニーノの墓の隣室。アッスールの許に部下がやって来て、アッスールが玉座に付く可能性はなくなったと告げる。半狂乱のアッスールは敵を倒すと誓う。
第５場。ニーノの墓廊。闇の中でセミラーミデが息子の無事を祈っている。アルサーチェが人の気配を察して剣を振り下ろした。しかしそこにいたのはアッスールではなく、セミラーミデであった。自分の母親を殺してしまい呆然とするアルサーチェ。隠れていたアッスールは衛兵に逮捕される。新しい国王アルサーチェ、つまりニーニャを讃える人々の合唱で幕となる。

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